Proyek Antibodi Terbuka adalah kolaborasi penelitian global yang dipromosikan bersama oleh UC Davis, NIH NeuroMab Facility, DSHB, dan Addgene. Hal ini bertujuan untuk mengatasi krisis reproduktifitas antibodi melalui standardisasi, transparansi, dan pembagian secara terbuka. Penerapannya bukanlah inisiatif yang longgar, melainkan proses rekayasa enam{2}}langkah yang dapat dijalankan, diaudit, dan direproduksi.
1. Standarisasi Perolehan dan Penyerahan Urutan Gen Antibodi
Sumber: Sel B spesifik-antigen diisolasi dari hewan yang diimunisasi atau pasien yang pulih menggunakan teknologi penyortiran sel B tunggal (seperti FACS). BCR mRNA diekstraksi dan diamplifikasi oleh RT-PCR untuk mendapatkan rangkaian V(D)J lengkap dari rantai berat dan ringan.
Persyaratan Format: Urutannya harus dalam format FASTA dan menyertakan anotasi untuk fragmen gen V, D, dan J.
Informasi imunogen (nama antigen, spesies, prosedur imunisasi) harus dicantumkan.
Asal kloning harus disebutkan (misalnya, "donor manusia #27, pasca-SARS-infeksi CoV-2").
Platform Pengiriman: Kirimkan data urutan mentah melalui formulir "Sarankan Plasmid" Addgene.
Poin Penting: Urutannya harus berupa gen antibodi rekombinan; penyerahan antibodi tanpa urutan yang berasal dari hibridoma dilarang.
2. Konstruksi Plasmid dan Perakitan Vektor Ekspresi Rekayasa
Pemilihan Vektor: Gunakan vektor ekspresi mamalia standar (misalnya, pCMV atau pEF1 ), pastikan masuknya wilayah konstan IgG1 Fc dan urutan Kozak.
Metode Kloning: Gunakan rakitan Gibson atau kloning Golden Gate untuk mendapatkan pasangan alami rantai berat dan ringan, hindari kombinasi acak.
Konvensi Penamaan Plasmid:
OpenAb_[Antigen]_[Spesies]_[CloneID]_v1
Contoh: OpenAb_SARS2_Spike_hu_047_v1
3. Pengajuan dan Peninjauan melalui Platform Addgene
Entri Pengiriman: Akses formulir Saran Plasmid Addgene
Kriteria Tinjauan: Urutan bebas dari kontaminasi dan mutasi frameshift; Plasmid berisi promotor dan terminator lengkap; Berikan peta plasmid (file .gb)
Waktu Peninjauan: Biasanya 7–14 hari kerja. Setelah disetujui, ID Addgene (misalnya, #123456) ditetapkan dan plasmid ditambahkan secara publik ke database.
Hasil: Plasmid menjadi sumber daya yang dapat dicari secara global, tersedia gratis bagi peneliti mana pun.
4. Pembuatan Standar dan Pengunggahan Data Validasi
Metode Validasi: Harus mematuhi lima pilar IWGAV (Kelompok Kerja Internasional untuk Validasi Antibodi):
|
Jenis Validasi |
Metode |
Persyaratan |
|
Validasi Genetik |
KO/knockdown CRISPR terhadap protein target |
Hilangnya atau berkurangnya pita WB secara signifikan |
|
Validasi Ortogonal |
Perbandingan dengan hasil spektrometri massa atau RNA-seq |
Pola ekspresi yang konsisten |
|
Validasi Antibodi Independen |
Validasi-silang menggunakan antibodi dengan epitop berbeda |
Hasil yang konsisten |
|
Validasi Fungsional |
Uji netralisasi, aliran sitometri |
Menunjukkan fungsi biologis yang diharapkan |
|
Validasi Aplikasi |
IHC, JIKA, WB, FC |
Pewarnaan khusus untuk aplikasi target |
Format Data:
Gambar IHC/IF: Harus menyertakan kontrol negatif (jaringan knockout) dan kontrol positif.
Gambar WB: Harus menyertakan penanda berat molekul dan kontrol internal (misalnya, -aktin).
Semua gambar harus diunggah dalam format TIFF lossless, bersama dengan parameter eksperimental (rasio pengenceran antibodi, waktu pemaparan).
Persyaratan Wajib: Semua data validasi harus dipublikasikan bersama dengan plasmid; tidak ada yang bisa diabaikan.
5. Distribusi dan Penggunaan Gratis Secara Global
Metode Akses:
Kunjungi Koleksi Plasmid Antibodi Addgene
Cari antibodi target (misalnya, "OpenAb_SARS2_Spike")
Kirimkan Perjanjian Penggunaan Non-Komersial (tidak perlu pembayaran)
Menerima plasmid (biasanya 5–10 hari kerja)
Pedoman Penggunaan:
ID Addgene dan sumber urutan asli harus dikutip di makalah.
Dorong pengiriman data validasi baru kembali ke Addgene untuk membentuk ekosistem{0}}loop tertutup.
6. Umpan Balik Berkelanjutan dan Iterasi Ekosistem
Mekanisme Umpan Balik Data: Pengguna mengunggah hasil eksperimen baru (misalnya, aplikasi baru, reaktivitas spesies baru) ke platform Addgene, membentuk database validasi dinamis.
Tata Kelola Komunitas: DSHB dan NIH secara rutin menerbitkan laporan kualitas antibodi, menghilangkan antibodi yang tidak efisien atau reaktif silang.
Hasil: Pada tahun 2025, 89% penelitian yang menggunakan antibodi sumber terbuka dapat direproduksi secara mandiri, jauh melebihi 45% penelitian antibodi komersial.
